在miRNA的研究中，验证miRNA与基因靶向关系是一个常见的任务。miRNA能够通过其种子序列（5’端第2-8个碱基）与mRNA的3’UTR区域结合，从而诱导细胞内部的沉默复合体介导mRNA降解或抑制mRNA翻译。基于这一原理，可以将目标基因的3'UTR区（或结合位点下游500bp）插入到荧光素酶报告基因载体luciferase的下游，随后与miRNAmimics共同转染入目标细胞中，添加底物以检测荧光素酶活性的变化。如果荧光素酶活性出现下调，这表明该miRNA与靶基因的3'UTR区域之间存在相互作用。

双荧光素酶报告基因检测用于验证miRNA与靶基因3'UTR相互作用的原理主要包括以下几个步骤：首先，利用生物信息学分析软件（如TargetScan、StarBase和miRanda等）进行miRNA靶基因的预测，分析特定靶基因的3'-UTR区序列中是否存在miRNA结合位点。然后，将预测能与miRNA结合的靶基因3'-UTR序列插入到载体中的萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）3'-UTR中。当miRNA与质粒中插入的序列结合时，miRNA会通过抑制荧光素酶的翻译，最终导致荧光值的降低，从而确认其相互作用。

进行miRNA与靶基因的相互作用的验证实验可以遵循以下步骤，如下所示：

实验材料与准备

- 细胞：HEK293细胞或明确指定的目标细胞
- 转染试剂：HieffTrans® invitrosiRNA/miRNA转染试剂（货号：40806ES）
- 报告基因检测试剂盒：双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：11402ES）
- 其他仪器耗材：酶标仪、细胞培养板等

实验步骤

若实验选择在目标细胞中进行，首先确认质粒瞬转效率是否达到40%以上，以保证实验的成功。如果达到要求，接下来按以下步骤进行：
a. 将状态良好的细胞用0.25%胰酶消化，加入完全培养基制作单细胞悬液，然后计数并播种于24孔培养板中。
b. 在细胞覆盖率达到约70%时，进行转染实验。
c. 转染前2小时更换培养基为新鲜的培养基。
d. 按照转染试剂的说明书准备转染。
e. 转染48小时后收集细胞样品。

A. 细胞样品收集：
a. 转染后轻轻吸净培养液，使用PBS洗涤细胞两次。
b. 每孔加入100μL的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer用无菌水稀释）。
c. 细胞裂解后，将样品转移入EP管中，保存于-80℃。

B. 根据报告基因检测试剂盒说明书进行检测：
a. 将充分裂解后的样品在10,000-15,000rpm下离心3-5分钟，转移上清液至新的EP管以进行后续检测。
b. 配置Renilla Luciferase Assay工作液，按照稀释比例将Renilla Luciferase Assay Reagent与工作液充分混合并静置。
c. 按照仪器说明进行荧光素酶检测，根据设定参数测定时间和间隔，将样品和混合试剂一起放入测量管中，测定RLU（相对光单位）。

实验预期结果

通过上述步骤，双荧光素酶报告基因检测可以有效验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用，已为基础研究及药物筛选进程提供了重要工具。我们推荐XPJ品牌的双荧光素酶报告基因检测试剂盒，以加快您的研究和实验进展。

相关产品清单

- 产品类别：双荧光素酶报告基因检测试剂
产品名称：Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit
产品货号：11402ES
产品规格：60/80 100T/1000T
- 产品类别：转染试剂
产品名称：HieffTrans® Liposomal Transfection Reagent
产品货号：40802ES
产品规格：01/03 100μL/1mL
以上产品均可通过XPJ渠道获取，以满足各类科研需要。